ENCAPSULACIÓN DE BACTERIAS LÁCTICAS PARA LA OBTENCIÓN DE ÁCIDO LÁCTICO POR FERMENTACIÓN DE LACTOSUERO Sofía I. Ruiz Miraglio (1), Rocío Boriglio (1), Luciana Belmonte (1), Paola Chiappero (1), Paula C. Garnero (1), Verónica V. Nicolau (1) (1) GPol, UTN, Facultad Regional San Francisco, Av. De la Universidad 501, (2400) San francisco, Córdoba, Argentina. e-mail de contacto: pcgarnero@gmail.com Resumen /D�H[SORWDFLyQ�GH�ORV�GHVHFKRV�LQGXVWULDOHV�VH�DSUHFLD�WDQWR�SRU�HO�FXLGDGR�GHO�PHGLRDPELHQWH�FRPR� SRU�HO�DKRUUR�HFRQyPLFR��(O�iFLGR�OiFWLFR��$/��HV�XQ�TXtPLFR�YHUViWLO�\�GH�DOWR�YDORU�FRQ�XQ�FUHFLHQWH� LQWHUpV�PXQGLDO�FRPR�SUHFXUVRU�GHO�SROL�iFLGR�OiFWLFR���3/$���(Q�HVWH�VHQWLGR��HO�ODFWRVXHUR�UHVXOWD� DWUDFWLYR�SDUD�SURGXFLU�$/�� (O�REMHWLYR�GH�HVWH�WUDEDMR�HV�REWHQHU�$/�SRU�IHUPHQWDFLyQ�GH�ODFWRVXHUR�HPSOHDQGR�XQD�FHSD�GH�OD� HVSHFLH� /DFWREDFLOOXV� GHOEUXHFNLL� VXEVS�� EXOJDULFXV� LQPRYLOL]DGD� HQ� XQD� PDWUL]� SROLPpULFD� TXH� SHUPLWD�VX�VHSDUDFLyQ�\�UHXWLOL]DFLyQ�DO�ILQDO�GH�OD�IHUPHQWDFLyQ��/D�HQFDSVXODFLyQ�GH�EDFWHULDV�HQ� DOJLQDWR�GH�VRGLR�SUHVHQWD�GLYHUVDV�YHQWDMDV�FRPR�PD\RU�GHQVLGDG�FHOXODU��YHORFLGDG�GH�UHDFFLyQ�\� SURGXFWLYLGDG�YROXPpWULFD� (Q�HVWH�WUDEDMR�VH�HYDOXy�HO�UHQGLPLHQWR�GH�OD�IHUPHQWDFLyQ�GLVFRQWLQXD�GH�ODFWRVXHUR�SRU�EDFWHULDV� GH�OD�HVSHFLH�Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus�HQFDSVXODGDV�HQ�XQD�PDWUL]�GH�DOJLQDWR� GH� VRGLR� HQ� FRPSDUDFLyQ� D� FpOXODV� OLEUHV�� 6H� GHWHUPLQy� OD� HILFLHQFLD� GH� OD� HQFDSVXODFLyQ� SRU� GHWHUPLQDFLyQ� GH� ODFWRVD� \� PHGLDQWH� OD�PHGLFLyQ� GHO� Q~PHUR� GH� FpOXODV� YLDEOHV� HQFDSVXODGDV� HPSOHDQGR�OD�WpFQLFD�GH�GLOXFLyQ�VHULDGD�\�VLHPEUD�HQ�SURIXQGLGDG�HQ�SODFD��(O�UHQGLPLHQWR�GH�OD� IHUPHQWDFLyQ� IXH�GH� �������HQ� HO� VLVWHPD�GH� FpOXODV� OLEUHV� \� �������HQ�HO� VLVWHPD�GH� FpOXODV� HQFDSVXODGDV��\�OD�SURGXFWLYLGDG�YROXPpWULFD�IXH�GH������J/��K���\������J�/��K����UHVSHFWLYDPHQWH�� (O�HPSOHR�GH�ODFWRVXHUR��VXESURGXFWR��R�UHVLGXR��PiV�DEXQGDQWH�GH�ODV�LQGXVWULDV�OiFWHDV��SHUPLWLUi� GLVPLQXLU�ORV�JUDQGHV�YRO~PHQHV�GHVHFKDGRV�\�ORV�FRQVHFXHQWHV�SUREOHPDV�GH�FRQWDPLQDFLyQ�SDUD� JHQHUDU�XQ�SURGXFWR�GH�DOWR�YDORU�DJUHJDGR�TXH�QR�VH�SURGXFH�HQ�QXHVWUR�SDtV� Palabras clave: encapsulación, fermentación, ácido láctico, bacterias ácido lácticas, lactosuero. Introducción El AL es un ácido carboxílico, con un grupo hidroxilo en el carbono adyacente al grupo carboxilo de fórmula (C3H6O3), este producto químico versátil y de gran valor despierta un creciente interés mundial como precursor de PLA. El AL es quiral, por lo que se pueden encontrar dos enantiómeros: uno es el dextrógiro ácido D-(+)-láctico o d-ácido láctico (en este caso, el ácido (R)-láctico); el otro es el levógiro ácido L-(-)-OiFWLFR�R�Ɛ-ácido láctico (en este caso, ácido (S)-láctico), que es el que tiene importancia biológica. La vía biotecnológica es indispensable para producir AL ópticamente puro [1]. Las bacterias lácticas se encuentran entre los microorganismos más prometedores para la bioconversión de diversos subproductos como es el lactosuero, subproducto más abundante de la industria láctea, generando un producto de alto valor agregado que no se produce en nuestro país y así poder reducir los consecuentes problemas de contaminación. La inmovilización de bacterias es una práctica prometedora en los procesos biotecnológicos que permite la reutilización de la biomasa en diferentes ciclos fermentativos. Se ha propuesto la reutilización de bacterias lácticas inmovilizadas para un máximo de 7 fermentaciones [2]. Además, esta tecnología presenta numerosas ventajas como mayor densidad celular, prevención de la inactivación interfacial, velocidad de reacción y productividad volumétrica. 536 El alginato de sodio es un polisacárido con características similares a los hidrogeles solubles en agua y ha sido empleado como matriz para la encapsulación de bacterias ácido lácticas donde el número de células libres encontradas post fermentación no se vio influenciado por el contenido de alginato [2,3]. En este trabajo se estudia la obtención de AL a partir de lactosuero y células de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus encapsuladas en una matriz de alginato de sodio en comparación a una fermentación con células libres. Se evalúa el rendimiento y la eficiencia de la encapsulación por determinación de lactosa y medición del número de células viables empleando la técnica de dilución seriada y siembra en profundidad en placa. Materiales y métodos Microorganismo Cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ATCC Nº 11842, subespecie de Lactobacillus con buena capacidad de producción de AL a partir de lactosuero. Bacteria ácido láctica homofermentante y productora de L-ácido láctico. Materiales Agar Man Rogosa Sharpe (MRS, Biokar), Caldo MRS (Biokar), Peptona de Carne (Merck), Suero en polvo, Solución NaOH 0.1N (Anedra), ácido fosfórico 50%, Alginato de sodio, Dicloruro de calcio, Citrato de sodio, Extracto de levadura, Triptona, Tween, Etanol. Todos los productos químicos utilizados son de grado analítico y microbiológico. Preparación del medio de fermentación Se preparó una solución con un contenido de lactosa de 4,4-5% a partir de 56 g de suero en polvo y 800 ml de agua destilada (70 g/l), en un vaso de precipitado. Para la precipitación de proteínas se ajustó a pH 4,25 con una solución de ácido fosfórico 50%, ya que está por debajo del punto isoeléctrico de las proteínas. Luego se trasvasó a un frasco autoclavable de 1L y se esterilizó a vapor fluente con esterilizador de vapor a presión portátil Numak. Las proteínas precipitadas se separaron por filtración al vacío empleando un embudo Büchner conectado a un kitasato y una bomba de vacío. El suero desproteneizado se enriqueció con extracto de levadura (20 g/l) y triptona (10 g/l) como fuente de nitrógeno y se adicionó 1 g/l de Tween 80 como antiespumante. Se ajustó a pH 6 con solución de NaOH 1N. Finalmente se separó un volumen equivalente a un 10% del volumen final del suero para la preparación del inóculo y se esterilizó en autoclave. Reactivación de la cepa de L. delbrueckii subsp. bulgaricus Para la reactivación se tomó 1 ml del conservado de la cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus empleando micropipeta BOECO Germany y se sembró en 10 mL de caldo MRS incubando durante 24 - 48 h a 37 °C. Se realizaron resiembras en tubos con Agar MRS, que se incubaron a 37 °C durante 24 - 48 h. Por último, se preparó el precultivo de 10 mL (inóculo) con suero desproteinizado enriquecido de nutrientes para que las bacterias se adapten al medio donde se llevará a cabo la fermentación. Se incubó a 37 °C durante 24 - 48 h. (Fig. 1) 537 Figura 1. Reactivación de BAL. Encapsulación de L. delbrueckii subsp. bulgaricus Para la inmovilización de las bacterias ácido lácticas se empleó la metodología de encapsulación en perlas de alginato de sodio descripta por Champagne y col. (1992) [2]. Para la producción de las perlas se sembró el inóculo de 10 mL en 100 ml de caldo MRS y se incubó a 37 °C durante 24 h. Las células se recuperaron por centrifugación a 5000 rpm a lo largo de 10 a 15 min. El precipitado de células se resuspendió en 25 ml de solución al 0,1% solución de peptona estéril, y esta suspensión se adicionó a una solución de alginato [2,3]. La suspensión de células en solución de alginato se adicionó por goteo en una solución 0,1 M de cloruro de calcio (CaCl2) bajo agitación magnética a 50 rpm y en condiciones de asepsia. Luego de 30 min de fortalecimiento en la solución de cloruro de calcio las perlas fueron recuperadas y lavadas. Las cantidades de alginato de sodio y de cloruro de calcio empleadas para la encapsulación se muestran en la Tabla 1. Las perlas fueron recuperadas por inmersión en una solución de etanol 60% durante 2,5 min a fin de eliminar células libres. Luego se realizaron lavados con solución de peptona 0,1% y fueron conservadas a 4°C. En la Figura 2 se muestran las fotos del sistema empleado para la síntesis de las perlas (a) así como una imagen de las perlas obtenidas (b). Tabla 1. Síntesis de perlas de alginato. Volumen de suspensión celular Solución de alginato de sodio Volumen de CaCl2 (0.1M) Perlas (ml) Volumen (ml) % (peso/volumen) Solución (ml) % alginato Peso húmedo (g) 10 ml 10 ml 2 250 ml 1,0 4,2 538 a) b) Figura 2. Encapsulación de L. delbrueckii subsp. bulgaricus en alginato de sodio: a) Síntesis, y b) Perlas. Fermentación Se llevaron a cabo 2 fermentaciones en lactosuero desproteinizado a 37°C durante 24 h empleando células inmovilizadas en comparación a las células libres. Los frascos cerrados se sumergieron en un baño calefactor orbital con agitación (50 rpm) marca Faitful Technology Pack (Figura 2). Figura 3. Sistema de fermentación. Métodos analíticos La concentración de lactosa se determinó por la titulación de lactosa a través de la técnica de Felhing, Causse y Bonnans. La muestra desproteinizada se colocó en la bureta de vástago acodado y se procedió a la titulación en ebullición de 15 mL de reactivo de FCB en 50 mL de agua destilada contenidos en un Erlenmeyer de 250 mL empleando azul de metileno como indicador. Los resultados se calcularon empleando la sig. Expresión [ec. (1)]: g lactosa/100 mL = x100 xX F V (1) 539 donde X es el título del reactivo de FCB, V (mL) es el volumen de la solución desproteinizada gastado en la titulación y F es el factor de dilución (F =10). Al tratarse de un método no estequiométrico se deben utilizar iguales volúmenes de reactivo FCB, la misma temperatura de calentamiento, concentraciones de azúcar similares, y el mismo tiempo de reacción. Sólo así las determinaciones serán comparables y los análisis reproducibles. La determinación debe efectuarse durante los dos primeros minutos de ebullición. Caso contrario, se cometen errores. Para medir el pH se empleó un pHmetro marca HANNA y un electrodo HI 8424. Para la determinación del número de células viables se utilizó la técnica de dilución seriada y siembra en profundidad en placa. El número total de células viables se expresó como UFC/mL. Para la determinación del diámetro de las perlas de las se empleó el software ImageJ. Se tomaron 5 perlas y se colocaron en una placa de Petri y se tomó una foto de cada una de las perlas. Se programó ImageJ para utilizar una escala real, se midieron los diámetros y se calculó el promedio. Este procedimiento se hizo antes y después de la fermentación. Resultados y discusión Para las células encapsuladas se partió de una concentración inicial celular de 3 x 107 UFC/mL y al final de la fermentación se observó un incremento celular de 2,02 x 109 UFC/mL. Por el contrario, para las células libres se partió de una concentración celular de 1,52 x 109 UFC/mL y al final de la fermentación su concentración disminuyó a 2,2 x 107 UFC/mL. Estos resultados sugieren una mayor protección de las bacterias encapsuladas lo que permite su multiplicación celular durante la fermentación y retarda la producción del metabolito. En ambas fermentaciones se partió de pH 6. Al final de las fermentaciones el pH descendió a pH 4,79 y 3,27 para el sistema con células inmovilizadas y el correspondiente a células libres. La disminución de pH es consecuencia de la producción de AL siendo mayor para el sistema de células libres. En el sistema encapsulado la protección de las cápsulas permite el crecimiento celular en su interior y retarda la producción de AL en concordancia a las mediciones de crecimiento celular. En la Tabla 2 se muestran las mediciones iniciales y finales de lactosa para ambas fermentaciones. A partir de las mediciones de lactosa se calcularon los rendimientos y productividades. El rendimiento y productividad de AL resultaron menor para el sistema encapsulado en concordancia con las mediciones finales de pH. El diámetro medio inicial de las perlas fue de 3,40 ± 0,23 mm y el final de 3,22 ± 0,37 mm observándose buena estabilidad a las condiciones de fermentación. Figura 5. Imagen de una perla. Software Image J. 540 Tabla 2. Fermentaciones: Rendimiento y Productividad. Células libres Células inmovilizadas Lactosa inicial (g/ 10 ml) 6,27 5,43 Lactosa final (g/10 ml) 3,72 4,29 Rendimiento (%) 40,2 21,1 Productividad (gL-1h-1) 0,17 0,10 Conclusiones La técnica de encapsulación resulta ser una herramienta prometedora para la obtención biotecnológica de AL. Las perlas de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus encapsulado en alginato de sodio resultaron estables a las condiciones de fermentación con una disminución del 5,3% en su diámetro medio. La baja productividad del AL para el sistema encapsulado en comparación al sistema de células libres, así como el elevado valor de pH final y el incremento de células viables sugieren una mayor protección celular que retarda la producción del metabolito. En trabajos a futuro se evaluarán mayores tiempos de fermentación para los sistemas encapsulados, así como modificaciones en las condiciones y recubrimiento de encapsulación a fin de mejorar el rendimiento y productividad. Agradecimientos A UTN por el financiamiento (PID 2020 PATCBSF0008135TC). Referencias [1] Ghaffar, T., Irshad, M., Anwar, Z., Agil, T., Zulifqar, Z., Tariq, A., Kamran, M., Ehsan, N., Mehmoo, S. (2014). 5HFHQW�WUHQGV�LQ� ODFWLF�DFLG�ELRWHFKQRORJ\��$�EULHI�UHYLHZ�RQ�SURGXFWLRQ�WR�SXUL¿FDWLRQ�� Journal of Radiation Research and Applied Sciences, 7(1), 1-8. [2@�&ODXGH�3��&KDPSDJQH��&KULVWRSKH�*DXG\��'HQLV�3RQFHOHW��5RQDOG�-��1HXIHOG�³/DFWRFRFXV�ODFWLV� 5HOHDVH�IURP�&DOFLXP�$OJLQDWH�%HDGV´��$SSOLHG�DQG�HQYLURQPHQWDO�PLFURELRORJ\��YRO������QR�����S�� 1429-1434, may 1992. (Received 12 November 1991/Accepted 10 February 1992) [3@� .RZDOVND�� (��� =LDUQR�� 0��� (NLHOVNL�� $��� � ĩHOD]LĔVNL�� 7�� �������� 0DWHULDOV� 8VHG� IRU� WKH� Microencapsulation of Probiotic Bacteria in the Food Industry. Molecules, 27(10), 3321. 541